精液冷冻保存不仅是现代畜牧业人工授精技术的关键环节,可以使精液不受时间、地域和种畜自身限制而进行种质资源之间的相互交流,而且便于提高优良种公畜的利用率、加快品种改良。精液冷冻保存稀释液作为精液冷冻保存成功的重要因素,可以有效减缓冷冻-解冻过程对精子造成的能量匮乏和氧化损伤,进而延长精子存活时间,改善冷冻-解冻后的精液品质,提高人工授精后母畜的受胎率。精子是一种高度特化的细胞,能够在雌性生殖道内游动并具有与卵子结合的受精能力。能量代谢的底物是精子发生、成熟和受精过程所必需代谢活动的关键组成部分,但精液稀释液代谢底物在奶山羊精子能量代谢过程中扮演的角色以及参与运动方式的具体作用机制依然不清楚。同时,山羊精子质膜富含不饱和脂肪酸(Polyunsaturated Fatty Acid,PUFA),导致精子对低温非常敏感,冷冻-解冻过程中容易累积过量的活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)而诱导精子发生氧化应激损伤,破坏精子膜结构,甚至使其丧失正常生理功能和受精能力,而脂质ROS攻击奶山羊精子的作用方式及其氧化损伤机制尚不清楚。因此,本研究首先从奶山羊精子能量供应的代谢途径和氧化应激损伤精子的作用方式出发,利用蛋白质组学和代谢组学测序技术探究冷冻-解冻过程导致奶山羊精子能量代谢和氧化应激的潜在调控机理;其次,采用“低糖+高糖”稀释液模型,分析奶山羊精液稀释液代谢底物与精子运动能力之间的关系;最后,建立精液稀释液氧化损伤模型,分析冷冻-解冻过程导致脂质ROS对奶山羊精子氧化损伤的作用机制。通过本研究以期明确冷冻-解冻过程中奶山羊精子能量代谢与运动方式的关系,揭示精子氧化损伤的作用机理,对于研发新型高效奶山羊精液冷冻保存稀释液,建立高效奶山羊冷冻精液人工授精技术,同时对奶山羊的遗传改良、提升繁殖效率等方面具有重要指导意义。本研究主要获得以下结果:1.奶山羊精液经过冷冻-解冻过程可造成精子致死或亚致死性损伤,其中精子活力、平均路径速率、曲线速率分别下降32.05%、8.05%和11.39%。通过TMT标记定量蛋白质组学分析技术检测奶山羊新鲜精液和冷冻精液之间的差异蛋白质,共鉴定到3015个蛋白,筛选出65个差异表达蛋白,其中34个差异蛋白上调,31个差异蛋白下调。GO注释分析结果表明,差异表达蛋白主要参与细胞进程、生物调节、代谢过程等生物进程,并参与结合活性和催化活性等分子功能调控。KEGG通路的聚类分析表明,差异表达蛋白质共富集到15个信号通路,主要参与氧化磷酸化、核糖体和细胞凋亡等通路,参与通路注释到ND3、COXVB、RANBP9、FBXL4、TRIM36和FTH1等蛋白质,且冷冻-解冻后ND3、RANBP9、CAPN11和FTH1蛋白丰度下调,表明ND3、RANBP9、CAPN11和FTH1蛋白可作为冷冻-解冻过程的奶山羊精子能量代谢紊乱和氧化损伤的潜在生物标记蛋白。2.利用非靶向代谢组学分析技术检测奶山羊新鲜精液和冷冻精液之间差异代谢物,共筛选出葡萄糖-6-磷酸、磷酸烯醇丙酮酸、山梨糖醇-6-磷酸钡盐、黄素腺嘌呤二核苷酸、衣康酸和顺乌头酸等388种差异代谢物,主要参与果糖和甘露糖代谢、脂肪酸生物合成、核黄素代谢和三羧酸循环(TCA循环)等55条代谢途径。蛋白质组学和代谢组学联合分析发现,主要参与谷胱甘肽代谢、嘌呤代谢和脂肪酸生物合成等9条信号通路,包括差异蛋白ACTB、ACSBG1、LOC102189813和差异代谢物FA 18:00、L-Gamma-Glutamyl-L-Amino Acid等,且冷冻-解冻后ACTB蛋白下调,ACSBG1蛋白和FA 18:00上调,提示差异蛋白和差异代谢物的变化可能参与维持奶山羊精子的能量稳态和氧化稳态平衡。3.为了探究冷冻-解冻前后ND3、COXVB等差异蛋白和葡萄糖-6-磷酸、衣康酸和顺乌头酸等差异代谢物的变化是否参与维持奶山羊精子的能量代谢稳态,采用“低糖+高糖”稀释液模型与精子共孵育,分析糖酵解和氧化磷酸化途径对精子运动功能的影响。结果显示,与高糖稀释液(370 m M葡萄糖)相比,低糖稀释液(75 m M葡萄糖)通过激活线粒体氧化磷酸化途径而促进奶山羊精子前向运动(68.31%±2.67%VS47.13%±2.46%,P<0.0001)和直线速率(73.83±2.435μm/s VS 37.01±1.68μm/s,P<0.0001)。根据冷冻-解冻前后精子线粒体ND3和COXVB差异蛋白,在低糖稀释液中添加20μmol/m L鱼藤酮、10μmol/m L碳酰氰-4-三氟甲氧基苯腙和40μmol/m L替加环素与精子孵育均可显著降低精子的运动性能、线粒体m PTP开放程度和ATP含量(P<0.05),并极显著减弱线粒体ND3、COX-1、COXVB、NRF1和TFAM蛋白表达水平(P<0.01),表明低糖稀释液通过激活精子线粒体活性并促进线粒体氧化磷酸化生成ATP,以维持精子的直线运动方式。与低糖稀释液相比,高糖稀释液可以诱发精子ROS水平(34.79%VS 27.3%,P<0.001)和MDA(0.66±0.009 nmol/mg VS 0.39±0.01nmol/mg,P<0.01)含量积累,通过介导铁死亡而极显著降低奶山羊精子活力(50.46%±1.8%VS 76.45%±0.95%,P<0.0001)、ATP(1.665±0.17 nmol/mg VS 5.1±0.21nmol/mg,P<0.0001)含量和MMP(0.91±0.03ΔΨm VS 3.7±0.06ΔΨm,P<0.0001)水平,表明低糖稀释液通过激活LKB1/AMPK通路维持精子能量稳态,以阻止精子铁死亡造成的氧化损伤。4.为了探究冷冻精液中FTH1差异蛋白上调以及冷冻-解冻过程产生脂质ROS是否诱导精子铁死亡,通过建立精子铁过载氧化损伤模型对精子铁死亡机理进行研究。结果表明,在奶山羊精液常温保存稀释液中添加5.0 mg/m L右旋糖酐铁与精子孵育5 h后可导致精子核膜膨胀破损并出现少量囊性空泡,精子线粒体出现外膜破裂、缺失和位置异常,进而极显著增加了ROS水平(36.47%VS 8.2%,P<0.0001)、LPO水平(34.98±1.62μmol/L VS 5.63±0.31μmol/L,P<0.0001)和MDA含量(3.02±0.13nmol/mg VS 2.01±0.12 nmol/mg,P<0.0001),并极显著降低了精子活力(26.78%±2.60%VS 82.87%±2.63%,P<0.0001)和MMP水平(2.332±0.22ΔΨm VS 2.98±0.34ΔΨm,P<0.01),而GSH含量(128.3±1.42μbiological implantg确认细节/mg VS 3.33±0.05μg/mg,P<0.0001)和SOD活性(0.811±0.08 U/mg VS 0.54±0.04 U/mg,P<0.001)极显著升高,导致过度激活Nrf2/HO-1信号通路,显著促进了ACSL4、DMT1、FTL和NCOA4蛋白的表达水平(P<0.05),而显著降低了SLC7A11、GPX4、DHODH和FSP1蛋白的表达水平(P<0.05)。同时,与铁过载损伤组相比,在5.0 mg/m L右旋糖酐铁稀释液基础上添加2μmol/L Fer-1和150 nmol/LMito Q孵育精子,分别极显著降低了ROS水平(38.44%VS 20.99%、38.44%VS 24.88%,P<0.0001)和MDA含量(1.75±0.03 nmselleck SAGol/mg VS 1.073±0.05 nmol/mg、1.75±0.03 nmol/mg VS 1.215±0.05 nmol/mg,P<0.0001),并极显著促进了SLC7A11、GPX4、DHODH和FSP1蛋白的表达水平(P<0.01),有效阻止了精子铁死亡。此外,与奶山羊精液常温保存相比,冷冻-解冻过程导致精子活力、质膜完整性、顶体完整性、ATP含量和MMP水平分别降低了30.53%、23.1%、34.5%、32%和26.5%,而ROS和LPO水平分别提高了33.9%和44.6%,并促进了ACSL4、DMT1、NCOA4和FTH1蛋白积累,提示冷冻-解冻过程引起精子NCOA4/FTH1结合导致铁蛋白自噬降解引发自噬依赖性铁死亡,从而导致精子功能受损。综上所述,本研究基于蛋白质组学和代谢组学对奶山羊精子冷冻-解冻前后关键分子标记物进行分析,解析了关键差异蛋白(ND3、COXVB、CAPN11和FTH1等)和差异代谢物(葡萄糖-6-磷酸、磷酸烯醇丙酮酸、衣康酸和顺乌头酸等)可能参与冷冻-解冻过程中精子能量代谢转换的调节来维持能量和氧化平衡。利用“低糖+高糖”葡萄糖稀释液解析精子可以根据代谢底物环境的不同调节运动方式,明确了低糖稀释液通过激活LKB1/AMPK信号通路维持精子能量稳态而抑制精子铁死亡。利用精子铁过载氧化损伤模型表明冷冻-解冻过程导致精子脂质ROS堆积,促进ACSL4、DMT1、NCOA4和FTH1蛋白积累,引起精子NCOA4/FTH1结合导致铁蛋白自噬降解而引发自噬依赖性铁死亡。本研究明确了低糖稀释液促进线粒体氧化磷酸化供能方式,并参与精子直线运动方式,揭示了冷冻-解冻过程激活Nrf2/HO-1抗氧化系统促进NCOA4/FTH1结合引发精子自噬依赖性铁死亡,为研发高效奶山羊精液冷冻保存稀释液和提高精液冷冻保存质量提供理论依据,并为建立奶山羊高效人工授精技术体系奠定基础。