环氧降冰片烷(EPO-NBE)是一种新杂环化合物的转化中间体,被广泛用于各类杂环系统的开发与构建。EPO-NBE主要通过繁杂的过渡金属复合物转化降冰片烯(NBE)来制备。工业化生产EPO-NBE仍缺乏一种高效且经济的生物合成方法。本研究开发了一种依赖过氧化氢(H_2O_2)的工程细胞色素P450过加氧酶(PpCytP),实现了EPO-NBE的生物合成;随后首次解析出PpCytP的晶体结构(PDB编号:7X53),并通过蛋白质工程提高其环氧化活性;此外,通过优化转化条件及分批添加H_2O_2等手段,进一步提高了两相体系的催化效率。主要的研究结果如下:(1)构建并验证了生物制备EPO-NBE的两相体系。首先筛选到恶臭假单胞菌来源的细胞色素P450酶(PpCytP)作为亲本酶;随后对表达条件和两相体系转化条件进行优化;最后,借助质谱(MS)和核磁共振图谱(NMR)确认了EPO-NBE的生成,进一步验证该转化体系的可行性。(2)蛋白质结晶和机制解析。首次获得PpCytP晶体结构(PDB编号:7X53);随后借助分子动力学模拟(MD)对PpCytP~(WT)-NBE对接模型进行分析,发现不适配的底物结合口袋导致过长的催化距离;进一步通过量子力学/分子力学计算(QM/MM)解析PpCytP催化环氧化机制,发现提高环氧化活性的关键是降低铁烷氧自由基复合物生成过程中的能sociology medical垒,而催化距离是影响该能垒的主要因素。(3)蛋白质工程提高PpCytP环氧化活性。设计了重构底物结合口袋从而适配NBE的改造策略,获得最优突变体PpCytP~(NPV)(PpCytP~(A250V/T255E/S296V/A297P/P298N))和重组菌株E.coli 05;PpCytP~(NPV)突变体酶活力为PpCytP~(WT)的7.54倍,k_(cat)/K_M值为PpCytP~(WT)的23.33倍。E.coli 05菌株生产EPO-NBE的产量达57.83 g·L~(-1),摩尔转化率为49.43%,相当于出发菌株的6.40倍;基于PpCytP~(NPV)-NBE对接模型的MD和QM/MM计Ferrostatin-1采购算表明:(i)局部疏水“栅栏”增加了PpCytP整体结构的稳定性,缩短了催化距离,增强了对NBE的亲和力;(ii)铁烷氧自由基复合物形成过程中的能垒降低了16.11 kcal·mol~(-1),表明Cpd I关键中间体更易攻击NBE生成EPO-NBE;(iii)Cpd 0质子化过程中的能垒降低了6.13kcal·mol~(-1),验证了Glu255残基参与质子转移并构建更高效的酸醇对系统的推论。(4)发酵罐规模生产EPO-NBE。首先采用分批添加H_2O_2来降低其对PpCytP~(NPV)活性的损耗;将转化LBH589体外体系放大到发酵罐水平验证了E.coli 05菌株的工业应用化潜力,在30 L发酵罐中,反应72 h后EPO-NBE产量可达77.59 g·L~(-1),摩尔转化率为66.32%。