药对是以七情和合为基础,以“相反相成、相须相成、相使相成、相制相成”为规律常用的两味中药的配伍组合。在中医临床实践中,往往两种药同时应用,比多味中药的复方要简单,又比单味中药有更好的疗效,还可减少毒性和副作用。因此,研究药对的配伍特点不仅有利于理解中医用药组方规律,并为中医临床实践提供价值参考。人参-酸枣仁药对是中医临床用药的经验累积,其应用已有千百年的历史。人参安神益智、补脾益肺,能调节中枢神经系统,治疗神经衰弱及神经退化性精神病。酸枣仁宁心安神,能提高人的记忆力,治疗失眠健忘、神志不守、心脏亏虚。两药合用,共奏安神补益之效,是治疗中枢神经系统疾病的常用药对。目的:本论文以人参-酸枣仁药对为研究对象,应用相关性分析结合活性筛选,获得人参-酸枣仁神经保护最优配伍比例。在此基础上,采用现代分析技术结合生物活性研究对该配伍比例对治疗帕金森的药效物质基础及作用机制展开研究,为更好地开发利人参-酸枣仁这一传统药对提供理论依据。方法:1、基于古今方剂数据挖掘人参-酸枣仁药对配伍特点及外延分析:本研究应用Excel和SPSS Modeler软件对涉及到人参-酸枣仁药对的古今方剂进行数据挖掘;采用Apriori算法分析人参、酸枣仁药味的炮制品种、应用剂量、配伍比例以及同方中药的配伍特点,获得其常用配伍比例与给药剂量以及同方中药的配伍特点,探讨人参-酸枣仁药对配伍的内涵及外延,对进一步合理应用该药对及相关开发药物及临床实践具有指导意义。2、基于熵权法和灰色关联度法结合成分研究优选出人参-酸枣仁药对神经保护最佳配伍比例:本研究应用灰色关联度分析法将不同配伍人参-酸枣仁药对的神经保护活性作用与化学成分含量之间建立相关性分析,系统全面的评价活性与成分之间的关系。进一步阐明天然产物多成分多靶点的作用特点,优Adavosertib小鼠选出人参-酸枣仁药对神经保护活性最佳配伍比例。3、人参-酸枣仁药对神经保护最佳配伍提取物药效物质基础研究:应用高效液相色谱、液质联用等现代分析技术对人参-酸枣仁药对神经保护最佳配伍提取物的化学成分展开相应研究;同时,应用高效液相色谱仪,建立其高效液相色谱指纹图谱,为人参-酸枣仁药对的进一步开发与应用提供理论依据。4、人参-酸枣仁药对神经保护最佳配伍提取物治疗ROT诱导的帕金森模型的作用机制研究:首先将实验所得的液质联用数据应用网络药理学进行靶点预测,得到人参-酸枣仁药对神经保护最佳配伍提取物治疗帕金森的活性成分及其潜在靶点。进一步,采用分子对接技术对人参-酸枣仁药对神经保护最佳配伍提取物治疗帕金森的潜在作用机制进行计算机预测。在此基础上,我们应用鱼藤酮诱导建立帕金森体内体外模型,采用流式细胞仪技术、免疫荧光、酶联免疫法、形态学研究、动物行为学、免疫组化、蛋白erg-mediated K(+) current质印迹法以及实时荧光定量等现代生物技术对其治疗帕金森的作用机制进行研究。结果:1、基于古今方剂数据挖掘的人参-酸枣仁药对配伍特点及外延分析:应用数据挖掘法检索并收纳含人参-酸枣仁药对的方剂598首,其源自162本医书,入载方剂主要源于宋、明、清三个朝代,归属为中医内科、妇科、儿科等6种疾病科属。人参组方应用剂量主要分布于11-15 g、21-30 g和31-50 g范围,酸枣仁组方使用剂量主要分布于16-30 g,均与安神、补益功效呈强关联,剂量范围与功效间的相关性表明临床用药可根据主治病症对两种药物进行适量加减。人参-酸枣仁药对配比频数统计分析显示,方剂功效与二者配比也存在一定相关性,主要分为1:1、1:2、2:1、3:2、1:4以上5种配伍比例,以1:1比例出现频次最高,此时目标方剂具有较强的安神、补益之功效。2、基于熵权法和灰色关联度法结合成分研究优选出人参-酸枣仁药对神经保护最佳配伍比例:将通过数据挖掘获得的人参-酸枣仁常用配伍比例(1:1、1:2、2:1、3:2、1:4)作为研究对象,对配比后的9种组分含量以及体外抗氧化活性、细胞抗氧化活性、谷氨酸诱导的细胞兴奋性损失和鱼藤酮诱导的细胞毒性为综合评价结合熵权法与灰色关联度分析,建立了人参-酸枣仁不同配比的质量评价模型。对人参-酸枣仁配比后的16个质量特性指标赋权,最终优选出人参-酸枣仁(1:1)为神经保护最佳配比。3、人参-酸枣仁药对神经保护最佳配伍提取物药效物质基础研究:运用液质连用技术对筛选得到的神经保护最佳配伍比例的人参-酸枣仁药对进行了化学成分研究,共鉴定得到包括皂苷类化合物:酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg6,黄酮类化合物斯皮诺素,多酚类化合物新绿原酸,三萜类化合物齐墩果酸以及脂肪酸类化合物亚油酸、硬脂酰胺等56个化合物。在此基础上,采用高效液相法,运用中药色谱指纹图谱相似度评价软件,利用多点校正法建立最佳配伍提取物的指纹图谱。通过对12批人参-酸枣仁神经保护最佳配伍提取物的HPLC(High Performance liquid chromatography)图谱进行处理,共标记出17个共有峰,使用对照品比对法,经过保留时间和色谱行为的相比,识别出斯皮诺素、当药黄素、人参皂苷Rg3、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、酸枣仁皂苷A、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、酸枣仁皂苷B、人参皂苷Rd在内的11个化合物,基本明确了人参-酸枣仁药对神经保护最佳配伍提取物药效物质基础。4、人参-酸枣仁药对神经保护最佳配伍提取物治疗ROT诱导的帕金森模型的作用机制研究:本研究通过网络药理学与分子对接得到人参-酸枣仁药对神经保护最佳配伍提取物治疗帕金森的潜在作用靶点为AKT1(V-akt murine thymoma viral oncogene homolog1)、TNF(Tumor necrosis factor)、TP53(Tumor protein p53)、CASP3(Recombinant Caspase3)、PTGS2(Prostaglandin-endoperoxide synthase 2);通路分析表明,人参-酸枣仁药对神经保护最佳配伍提取物治疗帕金森主要涉及到MAPK(Mitogen-activated protein kinase)信号通路、PI3K-Akt(Phosphatidylinositol-3-kinase/Protein kinase B)信号通路、细胞凋亡信号通路、神经营养素信号通路等。体外细胞模型研究表明该药对提取物可通过降低鱼藤酮造模后人神经母瘤细胞中活性氧水平,及抑制脂质氧化,并可通过提高抗氧化酶的活性,共同发挥修复氧化应激损伤的作用;同时,可以降低TNF-α、IL-6(Interleukin-6)和IL-1β(Interleukin-1β)等炎症因子的表达,起到抗炎的作用;应用RT-q PCR(Real time quantitative)对通路中的关键因子进行了m RNA的测定结果表明,人参-酸枣仁药对神经保护最佳配伍提取物可以通过调节PI3K-Akt通路中的PI3K、Akt的表达,从而抑制凋亡蛋白Caspes3的表达,起到治疗由ROT诱导的体外帕金森模型的作用。体内动物模型研究表明,人参-酸枣仁药对神经保护最佳配伍提取物可有效减缓模型组大鼠血清的氧化应激与炎症因子的表达,提高模型组大鼠脑内神经营养因子以及多巴胺的含量。蛋白免疫印迹实验结果表明,人参-酸枣仁药对神经保护最佳配伍提取物可以通过作用于PI3K-Akt通路起到治疗由ROT诱导的帕金森模型的作用。以上研究结果表明人参-酸枣仁药对神经保护最佳配伍提取物对ROT诱导的帕金森模型的治疗是多途径、多方位和多靶点共同发挥的治疗作用,符合整体调理的中医治疗特点。结论:本实验应用数据挖掘、灰色关联度分析得到人参-酸枣仁药对神经保护最佳配伍比例,在此基础上应用质谱分析、高效液相、免疫组化、蛋白免疫印迹等现代分析与生物技术等研究,初步论述了人参-酸枣仁药对神经保护最佳配伍提取selleck抑制剂物药效物质及对ROT诱导的帕金森模型的作用机制,为更好地开发利用人参-酸枣仁药对奠定了理论基础。