溃疡性结肠炎(Ulcer Colitis,UC)是一种病因不明的慢性和复发性肠道炎症性疾病,临床症状包含腹泻、便血、里急后重、腹痛和发热等,涉及肠上皮屏障功能缺失、免疫应答障碍、遗传易感等。其发病机制尚不明确,而免疫因素在UC的发生、持续和进展中受到越来越广泛关注。B细胞通过产生抗体或细胞因子、呈递抗原参与免疫反应,其中IgA是其分泌到胃肠道中最丰富的抗体,能够限制肠道致病微生物穿透肠上皮屏障。B细胞除了通过分泌IgA缓解肠道炎症,B220~+B细胞和CD138~+浆细胞也能通过产生IL-10抑制炎症。IL-35主要由Foxp3~+Treg细胞及调节性B细胞和树突状细胞分泌,其已被证实具有免疫抑制作用。在克罗恩病(Crohn’s disease,CD)患者的肠粘膜中能够检测到IL-35~+B细胞,但在UC患者中IL-35~+B细胞是否发挥保护作用尚不明确。IgG是血清中免疫球蛋白的主要成分,在肠道中产生的特异性IgG虽然能通过结合并清除致病性微生物控制感染,但也会与补体及其他细胞表面的Fc受体结合加重局部炎症反应。二甲双胍是一种腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)激活剂,主要用于Ⅱ型糖尿病的治疗。有研究表明,II型糖尿病患者接受二甲双胍治疗后,能够在肠道菌群的干预下合成胺类物质和短链脂肪酸,我们在先期研究中表明胺类物质具有肠道保护作用。本文旨在探讨二甲双胍能否发挥UC保护作用并研究其作用机制。研究目的:本研究通过葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导小鼠实验性结肠炎,研究二甲双胍是否能够通过调节B细胞发挥改善炎症性肠病作用。研究方法:(1)结肠组织病理:以3%DSS诱导小鼠溃疡性结肠炎,设置空白组(Control组)、对照组(DSS组)、二甲双胍处理组(DSS+MET组)进行实验,开始造模后每日记录小鼠体重、粪便性状和直肠出血情况进行DAI评分。颈椎脱臼法处死小鼠后测量各组小鼠结肠长度,通过肠组织HE染色切片观察结肠组织病理变化。(2)小鼠组织细胞因子表达检测:取小鼠结肠组织,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(q-PCR)、酶联免疫吸附实验(ELISA)检测IL-10、IL-35、IgA、IgG和IgM m RNA及蛋白表达水平。取小鼠眼内眦静脉血,ELISA检测血清IL-10、IL-35、IgA、IgG和IgM蛋白表达水平。取小鼠结肠和脾脏进行流式细胞术染色分析,比较给予二甲双胍后CD45~+IL-10~+、B220~+IL-10~+、CD138~+IL-10~+、CD45~+P35~+EBI3~+、B220~+P35~+EBI-3~+、CD138~+IgA~+、CD138~+IgG~+和CD138~+IgM~+细胞比例改变。(3)B细胞清除小鼠组织细胞因子检测:注射anti-CD20抗体清除小鼠体内B细胞,对照组注射纯化大鼠IgG2b同型对照试剂(purified rat IgG2b,isotype Control),7天后流式细胞术检测脾脏和肠系膜淋巴结CD19~+B220~+B细胞清除效率。共设isotype Control组、isotype+DSS组、isotype+DSS+MET组、anti-CD20Control组、anti-CD20+DSS组、anti-CD20+DSS+MET组六组小鼠,建立DSS诱导的溃疡性结肠炎模型。7天后处死小鼠,ELISA检测小鼠结肠组织IL-10、IgA、IgG和IgM蛋白含量。剩余结肠组织制备结肠上皮层和固有层单细胞悬液,流式细胞术分析CD138~+IgA~+细胞比例。(4)体外培养B细胞实验:分离小鼠脾脏细胞,分选出CD19~+B细胞,以q-PCR和ELISA检测二甲双胍对B细胞分泌IL-10、IL-35、IgA、IgG1、IgG2a和IgG2b的影响。(5)小鼠结肠组织表达谱分析:提取Control组、DSS组和DSS+MET组小鼠结肠组织总RNA,按照目标RNA分离与片段化、双链c DNA合成、连接接头、纯化分选、文库扩增和文库定量的步骤完成,以PE150方式测序,从DNAstar 18.0分析各组基因表达差异,并进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,通过q-PCR实验验证差异显著且具备功能的基因表达水平。研究结果:(1)在DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎模型中观察到二甲双胍能够减轻小鼠体重下降、腹泻和便血等症状,提高小鼠生存率。二甲双胍改善DSS引起的直肠狭窄和病理损伤,结肠组织病理观察显示二甲双胍干预后固有层和粘膜下层局部炎性细胞浸润面积减小,改善杯状细胞缺失等病理损伤。(2)二甲双胍干预后结肠炎小鼠结肠组织炎症抑制因子IL-10和IL-35的蛋白表达水平升高,结肠组织中IgA蛋白含量显著高于对照组。DSS+MET组肠粘膜上Canagliflozin MW皮层和固有层中CD45~+IL-10~+和CD138~+IgA~+细胞比例显著高于DSS组。(3)注射anti-CD20第7天时,小鼠脾脏和肠系膜淋巴结CD19~+B220~+细胞比例显著低于注射isotype组。记录各组小鼠体重下降、粪便性状和直肠出血情况,anti-CD20+DSS组DAI评分低于isotype+DSS组,anti-CD20+DSS+MET组DAI评分最低,而isotype+DSS组评分最高。ELISA结果表明isotype+DSS组小鼠结肠IgG含量显著高于anti-CD20+DSS+MET组,说明B细胞分泌的IgG可能加剧小鼠结肠炎的症状,二甲双胍可能通过降低IgG表达水平缓解溃疡性结肠炎。(4)在体外细胞培养实验中,二甲双胍能够提升B细胞IL-10、IL-35、IgA和IgG1的m RNA表达水平,下调有促炎功能的IgG2a m RNA表达水平。ELISA检测表明二甲双胍升高B细胞分泌IL-10蛋白水平,抑制IgG2a及IgG2b蛋白水平。(5)转录组测序分析表明,DSS组与Control组相比上调基因GO富集在补体激活经典途径(complement activation,classical pathway),KEGG富集在肿瘤坏死因子信号通路(TNF signialing pathway)通路,给予二甲双胍干预后下调基因也能够富集在上述通路中。DSS+MET组与DSS组相比上调基因GO富集在对细菌的防御反应(defense response to bacterium)条目,KEGG富集在精氨酸合成(arginine biosynthesis)通路。筛选Control组、DSS组和DSS+MET组小鼠结肠组织差异最显著基因进行q-PCR验证,Notch3基因在DSS组的m RNA表达水平显著低于Control组和DSS+MET组,表明二甲Nucleic Acid Electrophoresis Equipment双胍可能通过上调Notch3基因促进M2型巨噬细胞极化发挥抗炎作用。研究结论:二甲双胍提高溃疡性结肠炎小鼠生存率,缓解DSS引起的小鼠体重下降、粪Captisol分子量便性状改变、便血和结肠组织病理损伤。二甲双胍能够升高小鼠结肠组织IgA含量并降低IgG含量,在改善DSS诱导的小鼠结肠炎中发挥保护作用。在体外实验中二甲双胍能够抑制小鼠B细胞分泌具有促炎功能的IgG2a及IgG2b。转录组分析提示给予二甲双胍干预后小鼠结肠组织精氨酸合成增加,可能与促进IgA分泌相关;二甲双胍可能通过降低结肠组织IgG含量抑制补体激活的经典途径和肿瘤坏死因子信号通路。