研究背景:脑梗死,又称为Liraglutide NMR缺血性脑血管病,是一种因脑供血动脉狭窄或闭塞,导致脑供血不足而引起的脑组织坏死的疾病。脑梗死是导致死亡和长期残疾的主要原因之一,已成为最常见的威胁人类生命的神经系统疾病。全球每年约有1500万患者发生脑梗死,导致超过50万患者死亡,另有500万患者永久性残疾。此外,5年后复发性脑梗死的发生率为11.3%。虽然通过再灌注恢复血液供应可以改善临床结果,但快速再灌注也可能会导致脑损伤恶化。脑缺血再灌注(Ischemia-reperfusion,I/R)损伤已成为中风患者日益严峻的挑战。细胞死亡是所有组织中主要的常见的I/R损伤特征,因此是I/R损伤的稳定病理指标。铁死亡是由谷胱甘肽(glutathione,GSH)依赖性脂质过氧化物清除网络失效引起的一种非凋亡形式的调节性细胞死亡。铁死亡的发生依赖于铁和活性氧(reactive oxygen species,ROS),被认为是再灌注损伤的原因。铁死亡通常伴有脂质修复酶(谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4))功能障碍、大量铁积累和多不饱和脂肪酸脂质过氧化。它是由GPX4的活性丧失和随后的基于脂质ROS物质的积累驱动的。大脑由于其高代谢率和相对较低的抗氧化防御能力,易受ROS水平的影响,且由于脑部富含的膜结构中存在高浓度的多不饱和脂肪酸,使得大脑中的氧化损伤主要表现为脂质过氧化。且大脑是一个随年龄增加,铁易在其中逐渐蓄积的器官,而脑内铁蓄积易导致大量氧化自由基、过氧化物等的产生,从而引发脂质过氧化反应与蛋白质功能上的紊乱,最终导致神经元的变性、死亡。二氢杨梅素(Dihydromyricetin,DHM)是从木质藤本植物中提取的,主要活性成分是类黄酮。黄酮类化合物具有较好的清除氧自由基、抗氧化、抗血栓、抗炎、抗肿瘤等多种特殊作用。除了黄酮类化合AM-2282 molecular weight物的一般特性外,有研究表明,DHM对心肌I/R损伤、肝脏I/R损伤具有强大的保护作用。另外,DHM在脑梗死疾病中具有改善脑损伤的功效。近期研究表明DHM可通过激活Nrf2/HO-1信号途径抑制氧-葡萄糖剥夺/再恢复(oxygen-glucose deprivation and reoxygenation,OGD/R)导致的 HT22 细胞氧化应激与凋亡。这表明DHM可能在脑I/R损伤中具有保护作用。但目前尚不清楚DHM在脑I/R损伤中是否能改善脑损伤,及其通过何种机制改善脑损伤。我们对DHM可能的作用靶点进行分析,发现神经鞘氨醇激酶(Sphingosine kinase 1,SPHK1)、雷帕霉素靶蛋白mTOR为DHM的相关作用靶点。推测DHM可能是通过作用于SPHK1、mTOR在脑I/R过程中发挥保护作用。第一部分不同剂量DHM对脑I/R损伤大鼠的治疗作用目的:体内探究DHM在脑I/R损伤大鼠中的治疗作用及其对脑组织内铁死亡与SPHK1/mTOR信号途径的作用。方法:1.采用大脑中动脉闭塞/再灌注(middle cerebra l artery occlusion/reperfusion,MCAO/R)手术构建脑I/R损伤大鼠模型,并接受低、中、高剂量DHM(100、200、250mg/kg)的治疗处理。2.采用Zea Longa法进行行为学评分判断大鼠神经功能缺损情况。3.采用湿-干加权法检测脑组织中的含水量。4.采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色法评估脑梗死体积。5.采用TUNEL染色检测脑组织中细胞凋亡水平。6.Western blot检测脑组织内SPHK1、mTOR、p-mTOR以及铁死亡相关蛋白ACSL4、PEBP1、GPX4表达水平。结果:1.不同剂量DHM可改善脑I/R大鼠神经功能缺损。2.不同剂量DHM可减少脑I/R大鼠脑水肿及脑梗死体积。3.不同剂量DHM可减少脑I/R大鼠脑组织中细胞凋亡。4.不同剂量DHM可抑制脑I/R大鼠脑组织内SPHK1、p-mTOR、ACSL4和PEBP1蛋白表达,促进GPX4表达。结论:DHM能够改善脑I/R损伤,抑制SPHK1/mTOR信号途径和铁死亡相关蛋白的表达,且DHM对脑I/R损伤的治疗作用具有剂量依赖性。第二部分DHM在OGD/R诱导的神经元铁死亡中的作用目的:体外探究DHM对OGD/R诱导的小鼠海马神经元细胞(HT22)活性的影响及其对SPHK1/mTOR信号通路及铁死亡的作用。方法:1.体外通过OGD/R诱导HT22细胞建立脑I/R损伤的细胞模型,并经过不同浓度的DHM(1、10、20、30μM)处理。2.CCK-8实验检测HT22细胞增殖活性。3.流式细胞仪检测HT22细胞凋亡水平。4.ROS试剂盒检测细胞中ROS含量。5.铁含量检测试剂盒检测细胞内铁的含量。6.Western blot检测细胞内SPHK1、mTOR、p-mTOR以及铁死亡相关蛋白ACSL4、PEBP1、GPX4表达水平。结果:1.不同剂量DHM可提高OGD/R诱导的HT22细胞的增殖活性,且呈剂量依赖性。2.不同剂量DHM可减少OGD/R诱导的HT22细胞的凋亡,且呈剂量依赖性。3.DHM可减少OGD/R处理的HT22细胞中的ROS和铁含量。4.DHM 可抑制 OGD/R 处理的 HT22 细胞内 SPHK1、p-mTOR、ACSL4 和 PEBP1的蛋白表达,促进GPX4的表达。结论:DHM呈剂量依赖性增强OGD/R处理的HT22细胞的细胞活性并抑制细胞凋亡。DHM通过SPHK1/mTOR信号通路减少OGD/R处理的HT22细胞内铁死亡。第三部分DHM抑制OGD/R诱导神经元铁死亡的作用机制目的:体外探究DHM改善脑I/R损伤的作用机制。方法:1.体外通过OGD/R诱导HT22细胞建立脑I/R损伤的细胞模型,并经30μM DHM处理,之后转染si-GPX4、SPHK1过表达载体或MHY1485(mTOR激活剂)。2.CCK-8实验检测HT22细胞增殖活性。3.流式细胞仪检测HT22细胞凋亡水平。4.ROS试剂盒检测细胞中ROS含量。5.铁含量检测试eye infections剂盒检测细胞内铁的含量。6.Western blot检测HT22细胞内SPHK1、mTOR、p-mTOR以及铁死亡相关蛋白ACSL4、PEBP1、GPX4 表达水平。结果:1.DHM治疗可增加OGD/R处理的HT22细胞的活性,抑制细胞的凋亡,而沉默GPX4表达可抑制该作用。2.DHM治疗可减少OGD/R处理的HT22细胞内的ROS和铁含量,而沉默GPX4表达可促进ROS和铁含量的积累。3.DHM可抑制OGD/R处理的HT22细胞内ACSL4和PEBP1的蛋白表达,促进GPX4的表达,而沉默GPX4表达可促进铁死亡相关蛋白ACSL4和PEBP1的表达,抑制GPX4表达。4.DHM处理增强了 OGD/R处理的HT22细胞的细胞活力并抑制了细胞凋亡,但SPHK1过表达或MHY1485处理均削弱了 DHM的作用。5.DHM处理降低了 OGD/R处理的HT22细胞中脂质ROS和细胞内铁的水平,而SPHK1过表达或MHY1485处理增加了 ROS和细胞内铁含量。6.DHM处理导致OGD/R处理的HT22细胞中SPHK1表达降低和p-mTOR表达进一步降低。DHM处理对SPHK1和p-mTOR表达的影响通过SPHK1过表达或MHY1485处理得以挽救。结论:DHM通过抑制SPHK1/mTOR信号通路并调节GPX4表达减少了 OGD/R处理的HT22细胞中的铁死亡。