肿瘤多药耐药(Multidrug resistance,MDR)指肿瘤细胞对结构与机制不相关的化疗药物产生的耐药性的现象,是癌症化疗过程中面临的主要临床问题之一。肿瘤细胞中ATP结合盒(ATP-binding cassette,ABC)转运蛋白家族中的P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)过表达被认为是出现MDR的主要原因之一,因此在众多针对逆转MDR机制研究中,P-gp被认为是最有潜力的靶点,对P-gp抑制剂的研究也最为深入。尽管对P-gp抑制剂的开发与研究已有数十年的历史,但是由于各种原因,仍未找到能够有效调节P-gp并逆转MDR、恢复化疗疗效的P-gp抑制剂。目前P-gp抑制剂临床应用受限主要是由于以下原因:(1)对P-gp亲和力低;(2)临床试验中展现了不同程度的毒副作用;(3)与ABC家族其他的转运蛋白或细胞色素P450酶等产生相互作用;(4)缺乏有效的体内评价方法,多数体外实验结果与体内实验不一致。因此,在现有比较成熟的体外实验方法基础上,急需建立有效的P-gp抑制剂体内评价方法体系,更加全面的评价P-gp抑制剂作为化疗药物增敏剂的药效与安全性,为开发高效低毒的P-gp抑制剂以及后续临床应用提供科学依据与技术支撑。本课题组通过前期研究建立的P-gp抑制剂筛选方法,筛选得到粉防己碱(Tetrandrine,TET)、白花前胡乙素(Praeruptorin B,Pra-B)和黄芩新素(Skullcapflavone II,SF II)三个潜在P-gp抑制剂,体外实验表明三者均具有逆转MDR的活性,有望成为化疗药物增敏剂。因此,本课题以粉防己碱、白花前胡乙素和黄芩新素为研究对象,针对P-gp抑制剂体内药效评价体系建立的迫切需求,选用P-gp过表达的MCF-7/ADR肿瘤细胞构建荷瘤小鼠模型,紫杉醇(Paclitaxel,PTX)和阿霉素作为P-gp底物药物,从体内药效学、药代动力学、药物全身分布及潜在毒性等多维度,评价了上述三种中药潜在P-gp抑制剂在体内逆转肿瘤MDR的药效和安全性,并结合体外验证初步探讨其逆转MDR的内在机制,为潜在P-gp抑制剂的体内评价提供了技术手段,也为这三种中药活性单体成分作为P-gp抑制剂的应用提供了科学依据。本课题的研究内容分为以下三个部分:一、潜在P-gp抑制剂粉防己碱逆转肿瘤多药耐药的体内评价方法研究粉防己碱是一种双苄基异喹啉类生物碱,虽然已有报道证明其在体外对P-gp具有较好的抑制效果,但目前暂无相关体内研究报道。本研究以多药耐药肿瘤细胞MCF-7/ADR和荷瘤小鼠为模型,以紫杉醇为抗肿瘤药物,围绕粉防己碱作为P-gp抑制剂的体内评价,开展了药效学、药代动力学、药物全身分布及体外验证四方面的研究。采用组织块接种法构建乳腺癌移植瘤小鼠模型,将荷瘤小鼠分为对照组、单独给药紫杉醇组、单独给药粉防己碱组和联合给药组。多次给药后考察肿瘤生长趋势和紫杉醇的抑瘤率。建立小鼠血浆中紫杉醇和粉防己碱浓度的LC-MS/MS测定方法,进行荷瘤小鼠紫杉醇和粉防己碱的药代动力学研究;之后通过活体成像技术观察单独给药组和联合给药组荷瘤小鼠瘤体部位荧光标记紫杉醇的荧光强度。结合体外验证结果,探讨粉防己碱逆转肿瘤多药耐药的机制。抗肿瘤药效评价结果显示联合给药组的抑瘤率为50.37%,显著高于单独给药紫杉醇组的抑瘤率31.92%(P<0.05)。粉防己碱和紫杉醇的LC-MS/MS定量方法学验证结果表明各项指标都符合生物样品分析要求,可应用于荷瘤小鼠体内药代动力学研究。紫杉醇在荷瘤小鼠体内的药代动力学结果显示,联合给药组紫杉醇的达峰浓度为385.4 ng/m L,较单独给药组的达峰浓度提高了132.3%(P<0.05);单独给药组紫杉醇的AUC_((0-t))为557.8 h·ng/m L,联合给药组紫杉醇的AUC_((0-t))为1120.5 h·ng/m L,较单独给药组紫杉醇的AUC_((0-t))显著提高(P<0.05)。活体成像结果发现联合给药组荷瘤小鼠瘤体部位荧光强度显著高于单独给药组(P<0.05)。对荷瘤小鼠肿瘤组织中紫杉醇含量的测定结果也证实,联合给药粉防己碱和紫杉醇可以增加荷瘤小鼠瘤体中紫杉醇的蓄积。结合体外验证结果可知,粉防己碱在荷瘤小鼠体内可通过抑制P-gp的功能逆转肿瘤多药耐药性,增加紫杉醇在肿瘤组织中的蓄积,从而增强紫杉醇抑制肿瘤生长的药效。二、潜在P-gp抑制剂白花前胡乙素逆转肿瘤多药耐药的体内评价方法研究白花前胡乙素是从白花前胡干燥根中提取的角型香豆素。在第一部分实验结果的基础上,本章进行了P-gp抑制剂体内评价方法的进一步完善:药效学实验过程中监测荷瘤小鼠瘤体重量以及主要器官重量,以考察白花前胡乙素联用紫杉醇是否存在潜在毒性;采用SD大鼠进行药代动力学实验,以使实验结果覆盖更多种属的动物模型。本研究首先采用MCF-7/ADR细胞模型进行体外验证,结果显示联用5μM的白花前胡乙素可使阿霉素对MCF-7/ADR细胞的IC_(50)由32.80μM降低至5.37μM(P<0.05);将5μM白花前胡乙素与MCF-7/ADR细胞共孵育可显著下调MCF-7/ADR细胞中P-gp的表达(P<0.05)。采用组织块接种法构建乳腺癌移植瘤小鼠模型,分别考察联合口服给药15 mg/kg白花前胡乙素和30 mg/kg白花前IDN-6556浓度胡乙素对紫杉醇抗肿瘤功能的影响,结果显示联合给药30 mg/kg白花前胡乙素显著提升了紫杉醇的抑瘤率(P<0.05)。建立SD大鼠血浆中紫杉醇和白花前胡乙素浓度的LC-MS/MS测定方法,进行SD大鼠紫杉醇和白花前胡乙素的药代动力学研究,结果显示,联合给药15 mg/kg白花前胡乙素可以显著提高紫杉醇的达峰浓度(P<0.05)。活体成像结果显示白花前胡乙素对紫杉醇的全身分布无显著性影响。对荷瘤小鼠体重和脏器指数的监测结果显示各给药组间荷瘤小鼠的体重无显著性差异(P>0.05),且心脏与肝脏的脏器指数也不存在组间差异(P>0.05)。这表明15 mg/kg与30 mg/kg的白花前胡乙素对荷瘤小鼠均无潜在毒性。上述实验结果说明白花前胡乙素在荷瘤小鼠体内可以发挥逆转肿瘤多药耐药的功能,提高紫杉醇的抗肿瘤药效,且未见显著毒性,其机理可能与白花前胡乙素能够影响MCF-7/ADR细胞P-gp的表达有关。三、潜在P-gp抑制剂黄芩新素逆转肿瘤多药耐药的体内评价方法研究黄芩新素是一种黄酮类活性成分,目前对该中药单体的相关研究较少,且有研究表明一些黄酮类活性成分与P-gp间存在一定的相互作用。课题组前期的体外研究结果表明黄芩新素可抑制P-gp功能,其体内评价尚无相关报道。因此,本研究针对这一情况开展了黄芩新素逆转肿瘤多药耐药的药效学和药代动力学研究。本研究首先采用MCF-7/ADR细胞模型进行体外验证,结果显示联用2.5μM的黄芩新素可使阿霉素对MCF-7/ADR细胞的IC_(50)由32.80μM降低至21.11μM(P<0.05);而黄芩新素对MCF-7/ADR细胞中P-gp的表达没有显著影响。荷瘤小鼠模型体内药效学实验结果显示,联合应用5 mg/kg或15 mg/kg的黄芩新素均可显著提高紫杉醇的抑瘤率(P<0.05),延缓肿瘤组织的生长。结合荧光成像显示联合给药黄芩新素可以使荷瘤小鼠瘤体附近LY2157299体外的荧光强度增加这一结果,本研究推测荷瘤小鼠瘤体中PTX含量的增加或许是联合给药组荷瘤小鼠瘤体生长趋势减缓及抑瘤率上升的原因之一。SD大immune T cell responses鼠联合用药黄芩新素和紫杉醇的药代动力学结果显示,联合给药低剂量黄芩新素可使紫杉醇的达峰浓度显著下降(P<0.05),但对紫杉醇的全身暴露无显著性影响。最后,本实验通过荷瘤小鼠的体重变化及脏器指数初步判断了PTX联用黄芩新素的潜在相互作用,实验结果表明荷瘤小鼠在联合给药15 mg/kg黄芩新素和10 mg/kg紫杉醇后体重有明显变化(P<0.05),表明黄芩新素和紫杉醇联用的潜在相互作用可能存在剂量依赖性,提示对黄芩新素的后续开发需要关注其与抗肿瘤药物的药物-药物相互作用。综上,本课题以潜在P-gp抑制剂粉防己碱、白花前胡乙素和黄芩新素为研究对象,基于乳腺癌移植瘤小鼠模型结合活体成像技术的药效学评价,荷瘤小鼠模型和正常SD大鼠模型的药代动力学特征研究,以及基于荷瘤小鼠体重和主要脏器指数变化的潜在毒性评价,最终构建了多维度的P-gp抑制剂体内评价体系。实验结果表明三者均在荷瘤小鼠体内展现出了逆转肿瘤多药耐药的能力,粉防己碱和白花前胡乙素可以显著增加紫杉醇在血浆中的暴露,而黄芩新素对紫杉醇的体内暴露无显著性影响。同时黄芩新素联用紫杉醇导致的荷瘤小鼠体重下降提示两者联用可能存在药物-药物相互作用介导的潜在毒性。上述研究结果为P-gp抑制剂的体内评价提供了新方法与新思路,也为粉防己碱、白花前胡乙素和黄芩新素作为P-gp抑制剂的后续开发提供了科学依据和理论基础。