随着科技及祖国医药的日趋发展,在我国形成了独特的中西医结合的医疗模式,由此发展而来的中西药联合用药现象越来越普遍,不可避免的出现了一些临床问题,即合并用药所引起的中-西药药物相互作用。塞络通胶囊由人参、银杏叶和西红花提取物组方而成,有益气活血的功效,临床用于治疗气虚血瘀证血管性痴呆(VD)。由于他汀是VD患者常用基础药物,两者存在很高联用几率。为保障中西药联合治疗的有效性和安全性,本课题开展了中药复方塞络通(SLT)和阿托伐他汀(AT)药物相互作用的临床研究及相关机制解析。第一部分SLT与AT相互作用的临床研究1、生物分析方法的建立和验证采用LC-MS/MS建立了人血浆中AT及其代谢物邻羟基阿托伐他汀(2-HAT)、对羟基阿托伐他汀酸(4-HAT)、阿托伐他汀内酯(ATL)、邻羟基阿托伐他汀内酯(2-HATL)和对羟基阿托伐他汀内酯(4-HATL)的定量分析方法。血浆样本酸化后通过蛋白沉淀法处理。以甲醇:乙腈(1:1)为有机相,以水:甲醇AY-22989采购:乙腈(9:0.5:0.5)为水相,均含0.05%甲酸,进行梯度洗脱。电喷雾电离源,正离子模式、多反应监测扫描。对于无对照品的2-HATL和4-HATL采用相对定量。结果显示,前处理方法可有效防止酸型和内酯型间的构型转化。AT及其代谢物在0.1～25 nmol·L-1范围内线性关系良好,所有待测成分在5.5 min完成同时检测,精密度的RSD及准确度的RE值均小于15%,各种条件下稳定性良好。研究所建立的人血浆中AT及5种代谢物同时定量检测方法准确、快捷、灵敏、稳定,可用于临床药代动力学研究。2、SLT与AT在健康人体内的药物相互作用研究为考察SLT和AT在临床中的相互作用情况,首先开展了中药复方SLT与AT在健康人体内的相互作用研究。研究筛选纳入10例肝肾功能正常的汉族健康男性受试者,试验按照开放标签、单序列、自身对照、双周期设计。分别考察了单次(120 mg)和连续(120 mg,bid)服用SLT对AT(20 mg)的药动学影响。LC-MS/MS方法检测AT及各代谢物的血药浓度并计算药代参数。通过实验室检验指标考察安全性和血脂水平。结果显示,与服药前相比,单次服用SLT后,AT的AUC0-48和Cmax分别升高了 12.2%和37.5%;连续服用 SLT后,AT的 AUC0-48、Cmax分别降低了9.7%、26.3%(P<0.05);与单次服用SLT相比,连续服用SLT后AT的AUC0-48、Cmax分别显著降低了 19.5%、46.5%。主要代谢物的代谢率在单次SLT后均有所下降。实验室结果未见肌毒性和肝功指标异常,且与服药前相比,CK降低了 30.0%(P<0.01),血脂TC降低了 19.6%(P<0.001)。3、SLT与AT在VD患者体内的药物相互作用研究为探究两药联用在患者中发生药物相互作用的程度,研究进而开展了 SLT与AT合并用药在VD患者中的试验。纳入35名肝肾功能正常且正在服用阿托伐他汀或匹伐他汀钙(PIV)的气滞血瘀型VD患者。试验按照开放标签、单序列、自身对照设计。入组后首次采集他汀药后12 h静脉血,之后每日加服SLT(120 mg,bid)。合并用药达1、2和3个月时,再次采集他汀药后12 h血样。LC-MS/MS方法检测血药浓度,分析SLT对AT、PIV药物浓度的影响,同时监测试验过程中AT安全性和药效相关指标的变化。结果显示,连续合并服用SLT3个月后AT及其代谢物的血药浓度均呈现降低趋势,其中AT、4-HAT、ATL、4-HATL下降最为显著(P<0.05),PIV的血药浓度降低了10倍左右。安全性结果显示,肝功、肌毒性相关指标未见异常,试验过程无不良反应事件发生。在试验过程中血脂指标TG、TC、LDL和HDL在临床正常值范围内波动。4、SLT与AT在VD患者体内药代动力学研究研究基于小样本临床试验考察了气虚血瘀型VD患者合用SLT后对AT的药动学行为的影响。试验按照开放、自身对照、双周期设计。筛选纳入2名肝肾功能正常气滞血瘀型VD患者,在两周期内单独服用AT(20 mg,qd)或合并服用SLT(180 mg,bid)18天。在首、末日采集AT药后0～24.5 h静脉血,LC-MS/MS方法检测AT及各代谢物的血药浓度并计算药代参数。结果显示,与单独服用AT相比,连续服用SLT后,AT及其5种代谢物的AUC和Cmax值均大幅度降低了 70%～80%,且半衰期延长Fumed silica1～3倍。以上多项临床研究结果表明,SLT与AT合并用药能够产生明显的药物相互作用,单次和连续用SLT对健康受试者产生的影响不同;连续服用SLT显著降低了 AT在健康受试者和VD患者体内暴露水平。长期合并用药对代谢率的影响不能解释AT暴露水平下降的原因,从总生物利用度下降推测其可能与吸收水平的下降有关,相关机制需要进一步研究。第二部分SLT和AT发生相互作用的机制研究1、SLT对人肠道代谢酶及转运体的影响研究选用人肠腺癌上皮细胞(LS174T细胞)作为肠道药物相互作用(DDI)研究模型,RT-PCR检测LS174T细胞中的代谢酶、转运体及其上游调控基因的表达情况。优化以罗丹明123、AT和PIV为底物的细胞摄取活性评价方法。通过加入不同浓度SLT及组方西红花(XHH)、银杏(YX)和人参(RS)提取物共培养,分析SLT对转运体MDR1、细胞摄取他汀活性及对吸收相关代谢酶、转运体的诱导能力的影响及来源组分。单次共培养结果显示,高浓度的SLT对罗丹明123具有显著的促进胞内摄取作用,并显著促进肠道细胞对AT和PIV的吸收。组方中XHH能显著促进三种底物的胞内摄取。提示SLT存在对MDR1的抑制作用,主要来自XHH。48 h培养结果显示,高浓度SLT、组方中高浓度XHH、YX和RS能使胞内底物浓度显著升高,低浓度SLT及组方中XHH、YX和RS使胞内底物浓度降低;RT-PCR结果显示,高浓度的SLT和XHH均能够显著下调MDR1和OATP2B1的转录水平,低、中、高浓度的XHH和中、高浓度的YX均能上调CPY3A4。2、SLT对人转运体OATP2B1的影响以HEK293T细胞作为表达株,采用电穿孔法将OATP2B1质粒转入细胞核,构建HEK293-OATP2B1细胞模型。在对模型的表达和功能确认及对活性测定条件优化后,用含不同浓度SLT、XHH、YX和RS总提物培养基干预细胞对底物PIV或AT的摄取,采用LC-MS/MS测定胞内底物含量。结果显示,以AT为底物时SLT、XHH、YX和RS高、中浓度组胞内底物浓度显著低于对照组,YX和RS低浓度组胞内底物浓度显著高于对照组。以PIV为底物时SLT、XHH中、高浓度组和XHH低浓度组胞内浓度均显著低于对照组。3、SLT对人转运体MRP2的影响以MDCK细胞作为表达株,采用电穿孔法将MRP2质粒转入细胞核。在对模型的表达和功能确认及对活性测定条件优化后,用含不同浓度SLT、XHH、YX和RS总提物干预细胞对底物的摄取,测定细胞内MRP2特异底物CMFDA荧光浓度及AT和PIV浓度。结果显示,低、中、高浓度SLT及中、NVP-TNKS656高浓度YX及高浓度RS会使胞内CMFDA浓度升高。低、中、高浓度SLT,中、高浓度XHH、YX、RS使胞内AT浓度升高。低、中、高SLT和中、高浓度XHH使胞内PIV浓度均显著高于对照组。本部分研究通过多种细胞模型探明了 SLT与AT相互作用存在明显的转运体介导机制。SLT及其组分可抑制MDR1、MRP2及OATP2B1活性,又可诱导MDR1、CYP3A4转录水平。单次服用SLT升高他汀浓度可能来自对MDR1和MRP2外排活性的抑制,连续服用SLT引起他汀浓度下降与对肠道MDR1活性水平的诱导、摄取转运体OATP2B1表达及活性水平的下调作用及代谢酶CYP3A4表达水平的上调有关。现有结果显示XHH是最主要的作用来源组分。综上,本研究对SLT与AT合并用药在健康受试者及临床患者中产生的药物相互作用进行了系统性的探究,发现合用在单次和连续服用下产生不同的影响,连续服药会引起AT血浆暴露水平较大幅度的下降,在患者中作用更强。进一步的机制分析表明SLT可抑制肠道摄取转运体OATP2B1、外排转运体MDR1和,MRP2活性,并可诱导上调MDR1和CYP3A4、下调OATP2B1转录水平。基于这种复杂的相互作用机制,SLT可能在不同浓度下以及在肠道不同部位对吸收产生不同的综合效果。本研究结果可为SLT的临床合理用药提供科学依据和指导,并为中药复方HDI研究提供方法学参考。