研究背景根据联合国艾滋病规划署(Joint United Nations Programme on HIV-1/AIDS,UNAIDS)公布的最新数据显示,截止于2021年6月30日,艾滋病(Acquired Immunodeficiency Syndrome,AIDS)大流行已夺去4010万人的生命[3360万–4860万],是人类社会面临的公共卫生挑战之一。HIV(Human Immunodeficiency selfish genetic elementVirus,HIV)是艾滋病的致病病原,包括HIV-1和HIV-2,其中HIV-1是引发AIDS大流行的主要病原。HIV-1的前病毒主要由gag、pol和env组成,在其两端分布着一对相同的长末端重复序列(Long Terminal Repeat,LTR)。虽然LTR仅占前病毒全长的13.05%(1268/9719),但其至关重要。以5’LTR为例,它在HIV-1的逆转录、整合和转录调控中均起着关键作用,对HIV-1维持正常生命周期至关重要。因此,深入研究HIV-1 5’LTR基因多态性和转录调控功能,对HIV-1的传播、流行、预防和治疗均具有重要意义。然而,当前领域内对HIV-1 5’LTR的研究相对较少,主要体现在以下三个方面。第一,HIV Database数据库中LTR序列收录极少,仅占全部序列的0.086%(722/835940);第二,针对HIV-1基因多态性和基因功能的研究主要集中在内部区域,LAZD1152-HQPA IC50TR区域的相关研究少;第三,不同亚型的HIV-1 LTR中的细微的差异可以显著影响其启动子、增强子和转录因子结合位点的活性,以及HIV-1的复制动力学和毒力。然而国际上当前领域内针对LTR的转录功能研究主要集中于欧美B亚型,涉及其他亚型和流行重组毒株(Circulating Recombinant Forms,CRFs)的LTR功能研究相对较少,国内也鲜有文献对中国流行HIV-1亚型的LTR多态性及功能特征进行详细阐述。因此本研究聚焦于HIV-1毒株5’LTR基因多态性及转录活性。研究方法(1)采用多种质量控制策略,包括jpHMM,重组检测,系统进化分析等对HIV数据库中的序列进行筛选,根据领域内公认的参考序列确定4原则,构建LTR的参考序列体系,通过引入样本序列对参考序列体系进行检验和应用。(2)从中国HIV-1感染患者的血浆样本中提取病毒RNA,遵循HIV-1逆转录过程,通过逆转录和两轮PCR分别得到5’端和3’端的两部分不完整的LTR序列,通过相同的R区组合成一个完整的LTR。(3)在建立的分型系统的基础上,通过序列合成,酶切、连接、转化,提取质粒得到不同亚型的LTR的荧光报告质粒。并通过转染、筛选得到相应的稳转细胞株。采用荧光素酶活性检测的方法,进一步探讨中国流行的不同亚型的HIV-1毒株的5’LTR特征。(4)通过转录因子结合位点预测,分析并得到影响LTR转录活性的差异转录因子结合位点,利用荧光素酶活性检测的手段分析差异转录因子结合位点对LTR转录活性的影响。研究结果(1)首先我们经过系统的分型分LY2835219研究购买析,更新了HIV Database序列数据库中部分5’LTR序列分型信息,发现CRF02＿AG的LTR由G亚型和A1亚型重组而成。此外,基于系统进化分型的四大原则,从数据库中筛选获得76个单独5’LTR序列和302个具有完整基因组的5’LTR序列,成功构建了LTR的参考序列体系,结果显示一共有83条序列被选定为参考序列,包括2个Group、6个subtype、6个sub-subtype和9个CRF。(2)对于HIV Database中严重缺少5’LTR序列的现实,我们模拟自然状态下HIV-1的逆转录过程建立了基于HIV-1 RNA的LTR扩增方法,并扩增了我们收集的河北省和深圳市HIV-1感染者的血浆样本。结果显示,在河北省的样本中扩增得到了22个完整的LTR序列,3个序列为B亚型,8个序列为CRF01＿AE,3个序列为CRF07＿BC,2个序列为CRF08＿BC,3个序列为CRF55＿01B。并发现了CRF07＿BC和CRF01＿AE的重组体(HB010151和HB010161),B亚型和CRF08＿BC的重组体(HB030133)。在深圳市的样本中扩增得到了219个完整的LTR序列,9个序列为B亚型,146个序列为C亚型,3个序列为G亚型,61个序列为CRF01＿AE。其中有4个C亚型和CRF01＿AE的LTR的重组体,分别为LS13145、LS11614、LS14862和LS14863。(3)基于CRF01＿AE,CRF07＿BC,CRF08＿BC和CRF55＿01B这4种中国主要流行毒株的LTR的共享序列(consensus),分别构建了这4种CRF的LTR荧光报告表达质粒,并完成了对HEK 293T细胞和Hela细胞的转染,筛选出了共计10种稳转细胞株。通过荧光素酶报告实验,结果显示在中国流行的4种主要CRF的5’LTR的转录活性存在明显差异,其中CRF08＿BC的LTR转录活性最高,CRF01＿AE的LTR转录活性最低。(4)为探究CRF08＿BC和CRF01＿AE转录活性差异原因,通过转录因子结合位点的预测,发现NF-AT2转录因子在CRF08＿BC的LTR中单独存在并表现出分布差异,且位置单一。将CRF08＿BC的NF-AT2处的序列与CRF01＿AE进行交换,成功构建了突变后的CRF01＿AE和CRF08＿BC的荧光报告表达质粒,并转染HEK 293T细胞,筛选出了含有突变后的CRF01＿AE和CRF08＿BC荧光报告表达质粒的稳转细胞株。通过荧光素酶报告实验,我们发现CRF01＿AE得到NF-AT2后CRF01＿AE的荧光值升高,失去NF-AT2的CRF08＿BC的荧光值有小幅度的降低,提示NF-AT2转录因子结合位点可能是影响CRF01＿AE和CRF08＿BC LTR区域转录活性的关键原因之一。