H5N6亚型禽流感病毒(Avianinfluenzavirus,AIV)作为近年来中国广泛流行的高致病性禽流感病毒之一,对家禽养殖和公共卫生安全均构成了严重威胁。相关流行病学调查数据表明,国内流行的H5N6亚型AIV具有多种基因型,其中H6-like PB2基因逐渐取代H5-like PB2基因成为主要分离到的基因型。鉴于PB2蛋白是流感病毒聚合酶蛋白的关键组分,对病毒的复制和转录至关重要,因此有必要对含有不同进化谱系PB2基因的重组H5N6亚型AIV进行致病表型和复制能力的对比研究,评估其对家禽和哺乳动物的潜在危害并探讨相关机制。1.不同进化谱系PB2基因对重组H5N6亚型禽流感病毒致病表型的影响为评价不同进化谱系PB2基因对重组H5N6亚型AIV致病表型的影响,首先通过检索GISAID数据库对2014-2020年中国H5N6亚型AIV的PB2基因序列进行遗传进化分析,并结合本实验室前期流行病学调查数据,选取2株具有代表性的H5N6病毒A/Duck/Shandong/20201209/2020(简称 1209)和 A/Goose/Huaian/0124/2015(简称 0124),两者分别具有H6-like和H5-like PB2基因。然后通过反向遗传学技术,以1209株的8基因重组质粒为基础替换上0124的PB2基因重组质粒,拯救两株重组H5N6病毒r1209和r1209PB20124。接着测定了两株重组病毒的HA效价、EID50、MDT、TCID50和生长曲线等生物学特性并进行了 SPF鸡和BALB/c小鼠的致病性试验。结果显示,r1209PB20124相比较r1209毒株生物学特性无显著差异,但r1209PB20124感染MDCK细胞24h的病毒滴度显著高于r1209。以106.0EID50剂量攻毒SPF鸡和BLAB/c小鼠,两株病毒均造成感染动物100%死亡;但在感染鸡中,具有H6-like PB2基因的r1209病毒导致鸡的平均死亡时间要相对早于r1209PB20124;在感染小鼠中,具有H5-like PB2基因的r1209PB20124病毒则能够相对更快地致死小鼠,引起相对较强的宿主免疫反应。2.不同进化谱系PB2蛋白功能的差异性探究第一章的结果表明含有H6-like和H5-like PB2基因的重组H5N6亚型AIV(r1209和r1209PB20124)在禽类和哺乳动物体内具有不同的致病表型,为明确引起不同致病表型的原因,本章对不同进化谱系PB2蛋白功能进行差异性探究,对r1209和r1209PB20124株进行禽源细胞和哺乳源细胞的体外试验。首先,将PB2、PB1、PA和NP基因质粒共转染293T细胞,通过双荧光素酶报告基因检测系统测定聚合酶活性。结果显示,含有H5-like PB2基因的聚合酶在293T细胞中表现显著更高的活性和蛋白表达水平。随后,将两株重组H5N6病毒分别感染CEF细胞和MDCK细胞,测定不同进化谱系PB2基因的RNA(vRNA、cRNA和mRNA)表达水平与蛋白表达水平以及入核效率的差异。结果显示,在禽源CEF细胞中,r1209和r1209PB20124株的PB2基因的RNA与PB2蛋白的表达水平基本一致,但H6-like PB2蛋白进入细胞核明显早于H5-like PB2蛋白。在哺乳源MDCK细胞中,H5-like PB2基因的RNA与PB2蛋白的表达水平均显著更高,且H5-like PB2蛋白进入细胞核要明显早于H6-like PB2蛋白。因此,相较于H6-like PB2,H5-like PB2可能更有利于重组H5N6病毒在哺乳动物细胞中的复制。3.质谱鉴定H5N6亚型禽流感病毒不同进化谱系PB2差异互作宿主蛋白及其功能分析前两章体内和体外试验的结果均表明PB2基因影响H5N6亚型AIV在不同宿主中的致病性,本章进一步以鸡胚成纤维细胞DF1为细胞模型,从ATranslational ResearchIV自然宿主层面探究与不同进化谱系PB2蛋白互作的差异宿主蛋白及其生物学功能。首先利用质谱测序鉴定H6-like PB2和H5-like PB2的特异性互作蛋白以及二者共有的互作蛋白,随后对鉴定到的互作蛋白进行富集分析。KEGG通路分析表明与H6-like PB2互作的特异性蛋白,聚类在紧密连接、间隙连接、肌动蛋白细胞骨架的调节、内吞作用等通路下,与病毒的入侵及释放相关;与H5-like PB2互作的特异性蛋白多聚类在能量代谢相关的通路中,这其中的差异机制仍需进一步探索。随后,选取两个与病毒内吞和转运相关的禽源宿主因子RAB6A和RAB10验证互作,结果表明二者均可与不同进化谱系的PB2基因互作。此外,评估RAB6A和RAB10的RNA表达水平发现,过表达H6-like PB2蛋白可显著上调RAB10的表达水平。因此,H6-like PB2与RAB10存在互作同时调控RAB10表达,这一现象极有可能影响重组病毒感染进程。不同进化谱系PB2基因会影响重组H5N6亚型禽流感病毒在不同宿主体内的致病表型,含有H6-like PB2基因的重组H5N6亚型禽流感病毒r1209在SPF鸡体内表现更强的致病表型,含有H5-like PB2基因的重组H5N6亚型禽流感病毒r1209PB20124在BALB/c小鼠体内表现更强的致病表型。这一差异性或与PB2蛋白的功能相关。含有H6-like PB2基因的重组H5N6亚型禽流感病毒r1209在禽源CEF细胞中PB2diABZI STING agonist体内实验剂量蛋白更早进入细胞核。含有H5-like PB2基因的聚合酶在哺乳源293T细胞中表现更强的活性和蛋白表达水平,含有H5-like PB2基因的重组H5N6亚型禽流感病毒r1209PB20124在哺乳源MS-275MDCK细胞中PB2基因的RNA和蛋白表达水平显著更高且PB2蛋白更早进入细胞核。对致病表型的影响还要考虑宿主方面。通过质谱鉴定H5N6亚型禽流感病毒不同进化谱系PB2差异互作宿主蛋白并对其进行功能分析,在禽源DF1细胞中鉴定到与内吞和运输相关的宿主蛋白RAB6A和RAB10均与H6-like和H5-like PB2蛋白存在相互作用,且H6-like PB2可显著上调RAB10的表达,提示不同进化谱系PB2基因可能影响重组病毒在禽源宿主细胞的内吞作用,影响病毒感染进程。