放射治疗(radiationtherapy,RT)是治疗胸部恶性肿瘤方案中无法替代的重要手段,尽管放射治疗的方法不断优化改良,但辐射引起的放射性心脏损伤(radiation-induced heart damage,RIHD)仍不可避免,严重影响了放疗患者的生活质量和生存期。因此,从临床及其机制层面研究RIHD具有重要的实践意义。心律失常和心功能下降是RIHD最常见的临床表现,研究证实前者的发生与心脏神经重构相关,后者则与心肌纤维化(myocardial fibrosis,MF)密切相关。但目前RIHD后心脏神经重构和心肌纤维化的分子机制尚缺少研究。本课题对放射治疗患者的心电图变化、心肌损伤标志物Liproxstatin-1体内实验剂量、心脏超声等进行综合研究,并观察厄贝沙坦联合曲美他嗪对RIHD后心脏的保护作用,为临床早发现、早诊断及防治RIHD提供新的策略。结合RIHD的临床特点,进一步探讨RIHD后心脏神经重构和MF的分子机制,为防治RIHD相关的心律失常与心功能下降提供理论基础。第一部分胸部恶性肿瘤患者放射性心脏损伤的临床特点及厄贝沙坦联合曲美他嗪对心脏的保护性研究研究对象与方法选取2018年01月至2020年12月于山东省某三甲医院因胸部恶性肿瘤放疗患者300例,其中180例纳入临床特点研究,120例纳入厄贝沙坦联合曲美他嗪对RIHD后心脏保护性研究。临床特点研究中,根据治疗方案分为单纯放疗组、同步放化疗组和序贯放化疗组,根据是否出现RIHD分为RIHD组和对照组。比较放疗前后心电图、心肌损伤标志物等指标变化。与对照组比较,分析RIHD组心肌损伤标志物、心脏超声等指标的变化。药物保护性研究中,入选对象随机分为4组:单纯放疗组、厄贝沙坦组、曲美他嗪组和联合治疗组(厄贝沙坦组联合曲美他嗪),比较药物干预后常规心电图、24h动态心电图、心脏超声及血清cTnI、BNP、TNF-α、TGF-β1水平的变化。结果1.比较单纯放疗组、同步放化疗组和序贯放化疗组一般临床资料:包括性别、年龄、ECOG评分、肿瘤的位置、纵隔低剂量辐射(LDR)照射方式以及心脏的受照射剂量等,无统计学差异(P>0.05),资料具有可比性。3组间RIHD的发生率无显著差异(P>0.05)。2.与放疗前比较,放疗后常规心电图心律失常明显增加,24h动态心电图更显著,且随着放疗时间的延长逐渐加重(P<0.05或P<0.01)。3.与放疗前比较,放疗后2、4、6周血清cTnI、CK-MB、LDH、BNP水平均升高,且随放疗时间延长而加重(P<0.05)。4.与对照组比较,RIHD组放疗后6周血清cTnI、CK-MB、LDH、BNP水平均明显升高(P<0.05);RIHD患者中心脏超声左室舒张功能不全占比最高(36.79%);Spearman分析显示:E/A 比值与RIHD具有相关性(rs=0.652,P<0.05),E/A比值越高,RIHD发生率越高。5.比较单纯放疗组、厄贝沙坦组、曲美他嗪组和联合治疗组一般临床资料:包括性别、年龄、ECOG评分等,无统计学差异(P>0.05),资料具有可比性。6.与单纯放疗组比较,厄贝沙坦组、曲美他嗪组在常规心电图、24h动态心电图、心脏超声总异常率、E/A比值均www.selleck.cn/products/gdc-0068好转,联合治疗组更显著(P<0.05或P<0.01)。7.与单纯放疗组比较,厄贝沙坦组、曲美他嗪组血清cTnI、BNP、TNF-α、TGF-β1水平均降低,联合治疗组降低更显著(P<0.05或P<0.01)。结论1.心律失常是判断胸部恶性肿瘤放疗患者出现RIHD的敏感指标,而且随着放疗时间的延长和放射剂量的增加逐渐加重。2.RIHD患者血清cTnI、心肌酶谱、BNP水平明显升高,是判断RIHD的严重程度与预后的生物学标志物。3.RIHD患者左室舒张功能不全可能最早出现,心脏超声检查E/A比值是早期发现放射性心脏损伤的敏感指标。4.厄贝沙坦联合曲美他嗪可减少RIHD患者心律失常的发生,预防心功能下降,其机制可能是抑制了放射导致的心肌炎症反应和心肌纤维化。第二部分胸部放射对小鼠心脏神经重构的影响及miR-144抑制心肌纤维化的机制研究实验动物与方法建立RIHD小鼠模型,实验小鼠(C57BL/J)20只,随机分为10只照射小鼠为照射组,10只未照射小鼠为对照组。解剖后心脏切片用苏木精-伊红(HE)进行组织病理学染色,天狼猩红(PSR)进行胶原纤维染色。RT-qPCR检测GAP43和NGF mRNA表达,免疫组化检测GAP43、NGF、TH和CHAT蛋白表达的变化。通过生信分析寻找照射后心肌组织差异最明显的miRNA并进行验证。苏木精-伊红、天狼猩红组织染色比较照射后心肌组织纤维化程度。培养和分离心肌成纤维细胞(CFs),转染并照射。CCK8试剂盒检测细胞增殖,Transwell分析细胞Egg yolk immunoglobulin Y (IgY)迁移能力。RT-qPCR和Western Blotting检测CFs的表达。免疫荧光染色检测α-SMA的表达。生物信息学分析识别miR-144的靶基因CREB,荧光素酶检测进行验证。结果1.RT-qPCR结果显示,RIHD小鼠组织标本中GAP43和NGF mRNA的表达高于正常小鼠(P<0.001);免疫组化显示,RIHD小鼠组织标本中GAP43、NGF、TH和CHAT蛋白的表达高于正常小鼠(P<0.05)。2.生物信息学分析,与对照组比较,放射性心脏损伤组织中miR-144的logfc值负值最大,秩和检验分析miR-144差异有统计学意义(P<0.05)。3.苏木精-伊红、天狼猩红组织染色显示,与对照组比较,RIHD组心脏组织纤维化明显加重,miR-144的表达水平明显降低(P<0.05)。4.RT-qPCR结果显示,miR-144在CFs中的表达随放射剂量的增加而逐渐降低,而α-SMA、胶原蛋白Ⅰ和胶原蛋白Ⅲ水平相应地增加;CCK8检测结果显示,miR-144模拟物转染的CFs照射后细胞活力明显减弱(P<0.05)。5.与PBS组比较,胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ、CTGF、纤连蛋白和α-SMA在照射后转染miR-144模拟物的CFs中表达降低(P<0.05);免疫荧光染色显示,miR-144过表达可以降低照射过的CFs中α-SMA的表达。6.照射后转染miR-144拮抗剂的CFs表现出更强的扩散和迁移能力,胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ、CTGF、纤连蛋白和α-SMA表达明显增加(P<0.05)。7.生物信息学分析,显示CREB 3'UTR为miR-144结合位点,荧光素酶报告基因分析进行验证。Western Blotting分析显示,过表达miR-144可显著降低照射后CFs的CREB 蛋白水平(P<0.05)。结论1.放射后心脏神经重构可能是RIHD后心律失常的重要机制之一。2.放射后心肌纤维化明显加重,miR-144与RIHD心肌纤维化密切相关。过表达miR-144可减弱CFs的增殖和迁移,抑制miR-144可促进肌成纤维细胞向CFs分化、增殖和迁移。3.miR-144直接靶向调节CREB的表达,miR-144-CREB轴可能是治疗RIHD心肌纤维化的一个重要新靶点。